雙光子成像技術(shù)（Two-photon imaging）是一種基于非線性光學(xué)效應(yīng)的熒光顯微成像技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其在活體組織深層成像中具有顯著優(yōu)勢(shì)。其核心原理如下：

1. 雙光子激發(fā)（Two-photon excitation）

基本原理：

熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)低能量（長(zhǎng)波長(zhǎng)）光子，躍遷到激發(fā)態(tài)，隨后釋放一個(gè)高能量（短波長(zhǎng)）熒光光子返回基態(tài)。

能量關(guān)系：兩個(gè)光子的總能量需等于熒光分子單光子激發(fā)的能量，即E雙光子 =2×E單光子

波長(zhǎng)關(guān)系：激發(fā)光波長(zhǎng)約為單光子激發(fā)波長(zhǎng)的兩倍（例如，單光子用488 nm藍(lán)光，雙光子則用約800-1000 nm近紅外光）。

非線性光學(xué)效應(yīng)：

雙光子吸收的概率與光強(qiáng)的平方成正比，因此需要超短脈沖激光（飛秒激光）提供極高的瞬時(shí)功率，確保在焦點(diǎn)處發(fā)生有效激發(fā)。

2. 光學(xué)切片與三維成像

空間局域性：

雙光子激發(fā)僅發(fā)生在激光聚焦的極小微區(qū)（焦點(diǎn)附近），因?yàn)橹挥薪裹c(diǎn)處的光強(qiáng)足以觸發(fā)雙光子吸收。

無(wú)需共聚焦針孔：傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡需要針孔濾除非焦面信號(hào)，而雙光子成像自然抑制了背景噪聲，實(shí)現(xiàn)“光學(xué)切片”效果。

深層成像能力：

近紅外光（700-1300 nm）在生物組織中散射少、穿透深（可達(dá)1 mm以上），適合厚樣本（如腦組織、活體器官）成像。

減少光毒性：僅在焦點(diǎn)激發(fā)，避免非焦區(qū)域的光損傷和光漂白。

3. 成像系統(tǒng)組成

飛秒脈沖激光器：提供高功率、超短脈沖（~100飛秒）的近紅外激光。

掃描系統(tǒng)：通過(guò)振鏡或聲光偏轉(zhuǎn)器控制激光焦點(diǎn)在樣品中掃描。

探測(cè)器：高靈敏度光電倍增管（PMT）或雪崩光電二極管（APD），收集發(fā)射的熒光信號(hào)。

光學(xué)路徑：物鏡聚焦激光并收集熒光（通常采用非解像檢測(cè)，即不區(qū)分熒光方向）。

4. 優(yōu)勢(shì)與局限性

優(yōu)勢(shì)：

深層組織成像能力強(qiáng)，適用于活體研究。

光損傷小，適合長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測(cè)（如神經(jīng)元活動(dòng)）。

可結(jié)合熒光探針實(shí)現(xiàn)多種分子特異性標(biāo)記。

局限性：

設(shè)備復(fù)雜昂貴（依賴飛秒激光器）。

成像速度受限于激光掃描速率。

分辨率略低于共聚焦顯微鏡（受長(zhǎng)波長(zhǎng)衍射限制）。

5. 典型應(yīng)用

神經(jīng)科學(xué)：活體腦皮層神經(jīng)元鈣信號(hào)成像。

腫瘤研究：觀察腫瘤微環(huán)境中的血管生成和免疫細(xì)胞動(dòng)態(tài)。

發(fā)育生物學(xué)：胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞遷移的三維追蹤。

免疫學(xué)：淋巴結(jié)內(nèi)免疫細(xì)胞相互作用的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

總結(jié)

雙光子成像通過(guò)非線性光學(xué)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)高分辨、深層組織的熒光成像，是研究復(fù)雜生物系統(tǒng)動(dòng)態(tài)過(guò)程的重要工具，尤其在活體實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出不可替代的優(yōu)勢(shì)。