樣品要求:
R%XbO~{u 1.經(jīng)熒光探劑標(biāo)記(單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo))
yB(^t`)}N 2.固定的或活的組織
6R5) &L 3.固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞(Confocal專用小培養(yǎng)皿,蓋玻片)
#X7fs5$& 4.懸浮細(xì)胞,甩片或滴片后,用蓋玻片封
sj003jeko 一. 組成
%VsuGA 倒置或直立熒光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測針孔、熒光濾片系統(tǒng)、鏡掃描系統(tǒng)和光電倍增管)、掃描頭控制電路、計算機(jī)和圖像輸出設(shè)備
|/zE(ePc{ 二. 原理
iNf+ -C3 Confocal
9}t2OJS*h" 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測,來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點(diǎn)上,該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上,該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的,因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn),被探測點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示在計算機(jī)屏幕上,為了產(chǎn)生一幅完整的圖像,由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描,從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動,將樣品新的一個層面移動到共焦平面上,樣品的新層面又成像在顯示器上,隨著Z軸的不斷移動,就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。
v#:#w.]-Y 三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點(diǎn):
`p9h$d 1.點(diǎn)照明
+](^gaDw<L 2.具有照明pinhole和探測pinhole
f;#hcRSH 3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦), 共焦點(diǎn)即被探測點(diǎn),被探測點(diǎn)所在的平面為共焦平面
? e%Pvy<i 4.具有掃描系統(tǒng)―― 逐點(diǎn)掃描成像
G_=`&i"4 5.具有多個(四個) 熒光通道,可同時探測多個被標(biāo)記物
:<Y,^V( Leica TCS NT 的技術(shù)指標(biāo):
9)s=%dL 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x
xlkEW&N& 傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61l/NA
@rkNx@[~ Confocal: Rxy=0.4l/NA
%v:9_nwO) 2. 樣品的最大厚度:大約 2mm(10X/0.2物鏡)
K=VYRY 取決于三點(diǎn):
]~CGzV
物鏡的景深, 與NA成反比
^3IO.`| Z軸的最大移動范圍
Ix !O&_6s 激光的穿透力
s$J0^8Q~i 3. 樣品的最小光切厚度: 大約0.35 mm
PMjqcdBzm 取決于兩點(diǎn): 物鏡的數(shù)值孔徑NA
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