| opticsky |
2007-07-18 11:40 |
激光掃描共焦顯微鏡技術及其應用
樣品要求： }=!,o
1.經熒光探劑標記(單標、雙標、三標） kEd@oC
2.固定的或活的組織 K x~|jq
3.固定的或活的貼壁培養(yǎng)細胞(Confocal專用小培養(yǎng)皿，蓋玻片) m%PC8bf`S
4.懸浮細胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封 -Qn=|2Mm?
一. 組成 F!.E5<&7=
倒置或直立熒光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測針孔、熒光濾片系統(tǒng)、鏡掃描系統(tǒng)和光電倍增管)、掃描頭控制電路、計算機和圖像輸出設備 ^#0U ?9
二. 原理 TW^/sx
Confocal Y\0}R,]a-
利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。 [7 YPl9
三. 激光掃描共焦顯微鏡的設計特點: t5lO'Ll*Q]
1.點照明 V:G>G'Eh0
2.具有照明pinhole和探測pinhole v|E"[P2e
3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦), 共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面 =!Q7}z1QI
4.具有掃描系統(tǒng)―― 逐點掃描成像 lb:/EUd5
5.具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個被標記物 *]i!fzI']
Leica TCS NT 的技術指標: ;Q+xK h%
1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x |A8/F U2{
傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61l/NA lHV[Ln`\x
Confocal: Rxy=0.4l/NA , y%3mR_~
2. 樣品的最大厚度:大約 2mm(10X/0.2物鏡) #);[mW{F
取決于三點: c=AOkX3UD
物鏡的景深, 與NA成反比 mYU9
trHV
Z軸的最大移動范圍 FaBqj1O1
激光的穿透力 A 8 vbQ
3. 樣品的最小光切厚度: 大約0.35 mm @X3{x\i'I
取決于兩點: 物鏡的數(shù)值孔徑NA ",)Qc!^P$
Z軸的最小移動步距: 40nm
al `3Lu0
Z軸的分辨率: 0.35 mm .]
`f,^v<c
4. 激光器 rS1fK1dy s
Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm ]!IVz)<E&
Ar激光器(UV): 361nm iX\W; V
激光器的特點: I7&_Xr
1) 方向性好: 激光基本眼直線傳播 W0=O+0$^
2) 單色性好 l=10-8nm mR;qMX)0h
3) 高亮度: 激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集中的 Ssk}e=]
4) 偏振性: 激光為平面偏振光, 光纖耦合 R=T qj,6
5. 四個熒光通道, 一個透射光通道, 即除了可同時采集 {Ha8]y
多標記熒光圖像外還可以同時采集透射光圖像,但透 }za[E>z
射光圖像為非共焦圖像 <40rYr$/J
四. 共焦顯微鏡的類型： IuZ) [*W
1.點(慢)掃描共焦顯微鏡: 分辨率高, 圖像清晰; 9 fMau
噪音低; XO <y +
采集圖像速度慢; 1jX3ey~
目鏡中觀察不到共焦圖像; 5Q=P4w!'
2.線(狹縫)掃描共焦 顯微鏡(video rate): 分辨率低; oBUxKisW
噪音高; 'Z`$ n8
掃描速度快 240幅/秒; "@9? QI}
目鏡中可觀察到共焦圖像 x F8} :z0
3.Nipkov轉盤式掃描共焦顯微鏡: 性能介于上述兩者之間 F]m gmYD%
功能:1.多熒光標記樣品的圖像采集 "z<azs
2.無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“CT” F}
d
3.真正的三維重組 ]qB:PtX
4.假三維圖的顯示 <A9y9|>o
5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進行光切 8?Z4-6!{V,
6.定量分析 H_? o-L?+
7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 掃描―― 時間序列掃描 v2,%K`pAU
8.圖像處理 .`CZUKG
9. 旋轉掃描 6'W
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