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光行天下 -> 顯微鏡,望遠鏡光學(xué)設(shè)計 -> 顯微鏡和望遠鏡的原理對比分析 [點此返回論壇查看本帖完整版本]

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2008-04-14 20:56

顯微鏡和望遠鏡的原理對比分析

早在公元前一世紀(jì)，人們就已發(fā)現(xiàn)通過球形透明物體去觀察微小物體時，可以使其放大成像。后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認識。 1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)造出類似顯微鏡的放大儀器。1610年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當(dāng)時的光學(xué)工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進。 17世紀(jì)中葉，英國的胡克和荷蘭的列文胡克，都對顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻。1665年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調(diào)焦機構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標(biāo)本片的工作臺。這些部件經(jīng)過不斷改進，成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分。 1673～1677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡，其中九臺保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡，在動、植物機體微觀結(jié)構(gòu)的研究方面取得了杰出成就。 19世紀(jì)，高質(zhì)量消色差浸液物鏡的出現(xiàn)，使顯微鏡觀察微細結(jié)構(gòu)的能力大為提高。1827年阿米奇第一個采用了浸液物鏡。

19世紀(jì)70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎(chǔ)。這些都促進了顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的迅速發(fā)展，并為19世紀(jì)后半葉包括科赫、巴斯德等在內(nèi)的生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)細菌和微生物提供了有力的工具。在顯微鏡本身結(jié)構(gòu)發(fā)展的同時，顯微觀察技術(shù)也在不斷創(chuàng)新：1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)；1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)；1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎。古典的光學(xué)顯微鏡只是光學(xué)元件和精密機械元件的組合，它以人眼作為接收器來觀察放大的像。后來在顯微鏡中加入了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器。現(xiàn)代又普遍采用光電元件、電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計算機后構(gòu)成完整的圖像信息采集和處理系統(tǒng)。目前全世界最主要的顯微鏡廠家主要有：奧林巴斯、蔡司、徠卡、尼康。國內(nèi)廠家主要有：江南、麥克奧迪等。
二、顯微鏡的基本光學(xué)原理
（一）折射和折射率光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點之間以直線傳播，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。當(dāng)與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體(如玻璃)時，光線在其介面改變了方向，并和法線構(gòu)成折射角。

（二）透鏡的性能透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的最基本的光學(xué)元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和多個透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負透鏡)兩大類。當(dāng)一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點，這個點稱"焦點"，通過交點并垂直光軸的平面，稱"焦平面"。焦點有兩個，在物方空間的焦點，稱"物方焦點"，該處的焦平面，稱"物方焦平面"；反之，在象方空間的焦點，稱"象方焦點"，該處的焦平面，稱"象方焦平面"。光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實像。實像可在屏幕上顯現(xiàn)出來，而虛像不能。

（三）凸透鏡的五種成象規(guī)律 1. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點以外形成縮小的倒立實象； 2. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象； 3. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象； 4. 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象； 5. 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點以內(nèi)時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠的位置形成放大的直立虛象。

三、光學(xué)顯微鏡的成象（幾何成象）原理只有當(dāng)物體對人眼的張角不小于某一值時，肉眼才能區(qū)別其各個細部，該量稱為目視分辨率ε。在最佳條件下，即物體的照度為50~70lx及其對比度較大時，可達到1'。為易于觀測，一般將該量加大到2'，并取此為平均目鏡分辨率。物體視角的大小與該物體的長度尺寸和物體至眼睛的距離有關(guān)。有公式y(tǒng)=Lε 距離L不能取得很小，因為眼睛的調(diào)節(jié)能力有一定限度，尤其是眼睛在接近調(diào)節(jié)能力的極限范圍工作時，會使視力極度疲勞。對于標(biāo)準(zhǔn)(正視)而言，最佳的視距規(guī)定為250mm(明視距離)。這意味著，在沒有儀器的條件下，目視分辨率ε=2'的眼睛，能清楚地區(qū)分大小為0.15mm的物體細節(jié)。在觀測視角小于1'的物體時，必須使用放大儀器。放大鏡和顯微鏡是用于觀測放置在觀測人員近處應(yīng)予放大的物體的。

（一）放大鏡的成像原理表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學(xué)透鏡可以使物體放大成像，光路圖如圖1所示。位于物方焦點F以內(nèi)的物AB，其大小為y，它被放大鏡成一大小為y'的虛像A'B'。放大鏡的放大率 Γ=250/f' 式中250--明視距離，單位為mm f'--放大鏡焦距，單位為mm 該放大率是指在250mm的距離內(nèi)用放大鏡觀察到的物體像的視角同沒有放大鏡觀察到的物體視角的比值。

（二）顯微鏡的成像原理顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。圖2是物體被顯微鏡成像的原理圖。圖中為方便計，把物鏡L1和目鏡L2均以單塊透鏡表示。物體AB位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像A'B'。 A'B'位于目鏡的物方焦點F2上，或者在很靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛觀察。虛像A''B''的位置取決于F2和A'B'之間的距離，可以在無限遠處（當(dāng)A'B'位于F2上時），也可以在觀察者的明視距離處（當(dāng)A'B'在圖中焦點F2之右邊時）。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。

（三）顯微鏡的重要光學(xué)技術(shù)參數(shù) 在鏡檢時，人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象，這就需要顯微鏡的各項光學(xué)技術(shù)參數(shù)達到一定的標(biāo)準(zhǔn)，并且要求在使用時，必須根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調(diào)各參數(shù)的關(guān)系。只有這樣，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的性能，得到滿意的鏡檢效果。顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，在使用時，應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調(diào)參數(shù)間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準(zhǔn)。

1、數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑簡寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標(biāo)志。其數(shù)值的大小，分別標(biāo)刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和孔徑角（u）半數(shù)的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2 孔徑角又稱"鏡口角"，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑角越大，進入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率n值。基于這一原理，就產(chǎn)生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率n值大于1，NA值就能大于1。數(shù)值孔徑最大值為1.4，這個數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡的NA值。數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影響著其他各項技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應(yīng)地變小。 2．分辨率顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的最小間距，又稱"鑒別率"。其計算公式是σ=λ/NA 式中σ為最小分辨距離；λ為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑。可見物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則σ值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小σ值，可采取以下措施
（1）降低波長λ值，使用短波長光源。
（2）增大介質(zhì)n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。
（3）增大孔徑角u值以提高NA值。
（4）增加明暗反差。

3、放大率和有效放大率由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率Γ應(yīng)該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積： Γ=βΓ1 顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調(diào)換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯(lián)系的概念。有關(guān)系式：500NA<Γ<1000NA 當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結(jié)構(gòu)，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。
4、焦深焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當(dāng)焦點對準(zhǔn)某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：
（1）焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔徑成反比。
（2）焦深大，分辨率降低。由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時造成困難。在顯微照相時將詳細介紹。
5、視場直徑（Field Of View）觀察顯微鏡時，所看到的明亮的圓形范圍叫視場，它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。有公式 F=FN/β 式中F: 視場直徑，F(xiàn)N：視場數(shù)（Field Number, 簡寫為FN，標(biāo)刻在目鏡的鏡筒外側(cè)），β:物鏡放大率。由公式可看出：
（1）視場直徑與視場數(shù)成正比。
（2）增大物鏡的倍數(shù)，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。

6、覆蓋差顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質(zhì)量。國際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。
7、工作距離WD 工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個概念，平時習(xí)慣所說的調(diào)焦，實際上是調(diào)節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。
（四）物鏡物鏡是顯微鏡最重要的光學(xué)部件，利用光線使被檢物體第一次成象，因而直接關(guān)系和影響成象的質(zhì)量和各項光學(xué)技術(shù)參數(shù)，是衡量一臺顯微鏡質(zhì)量的首要標(biāo)準(zhǔn)。物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，制作精密，由于對象差的校正，金屬的物鏡筒內(nèi)由相隔一定距離并被固定的透鏡組組合而成。物鏡有許多具體的要求，如合軸,齊焦。齊焦既是在鏡檢時，當(dāng)用某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后，在轉(zhuǎn)換另一倍率的物鏡時，其成象亦應(yīng)基本清晰，而且象的中心偏離也應(yīng)該在一定的范圍內(nèi)，也就是合軸程度。齊焦性能的優(yōu)劣和合軸程度的高低是顯微鏡質(zhì)量的一個重要標(biāo)志，它是與物鏡的本身質(zhì)量和物鏡轉(zhuǎn)換器的精度有關(guān)。現(xiàn)代顯微物鏡已達到高度完善，其數(shù)值孔徑已接近極限，視場中心的分辨率與理論值之區(qū)別已微乎其微。但繼續(xù)增大顯微物鏡視場與提高視場邊緣成象質(zhì)量的可能性仍然存在，這種研究工作，至今仍在進行。顯微物鏡與目鏡在參于成象這點上是有區(qū)別的。物鏡是顯微鏡最復(fù)雜和最重要的部分，在寬光束中工作(孔徑大)，但這些光束與光軸的傾角較小(視場小)；目鏡在窄光束中工作，但其傾角大（視場大）。當(dāng)計算物鏡與目鏡，在消除象差上有很大差別。與寬光束有關(guān)的象差是球差、慧差以及位置色差；與視場有關(guān)的象差是象散、場曲、畸變以及倍率包差。顯微物鏡是一消球差系統(tǒng)。這意味著：就軸上的一對共軛點而言，消除了球差并且實現(xiàn)了正弦條件時，每一物鏡僅有兩個這種消球差點。因此，物體與象的計算位置的任何改變均導(dǎo)致象差變大。
1、物鏡的主要參數(shù)
（1）放大率β
（2）數(shù)值孔徑NA
（3）機械筒長L：在顯微鏡中，物鏡支承面到目鏡支承面之間的距離稱為機械筒長。對于一臺顯微鏡來說，機械筒長是固定的。我國規(guī)定機械筒長是160毫米。
（4）蓋玻片厚度d
（5）工作距離WD 這些參數(shù)，大多刻在物鏡筒上，如圖3所示。有一種所謂筒長無限的顯微物鏡，這種物鏡的后方一般帶有輔助物鏡（也叫補償物鏡或鏡筒物鏡），被觀察物體位于物鏡前焦點上，經(jīng)過物鏡以后，成像在無限遠，再經(jīng)過輔助物鏡成像在輔助物鏡的焦平面上，如圖4所示。在物鏡和輔助物鏡之間是平行光，所以中間距離比較自由一些，可以加入棱鏡等光學(xué)元件。
2、物鏡的基本類型
（1）按顯微鏡鏡筒長度（以mm計）：透射光用160鏡筒，帶0.17mm厚或更厚的蓋玻片；反射光用190鏡筒，不帶蓋玻片；透射光與反射光用鏡筒，筒長無限大。
（2）按浸法特征：非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。