當(dāng)紫外光照射某一物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)會(huì)在極短的時(shí)間內(nèi)，發(fā)射出較照射波長(zhǎng)為長(zhǎng)的光。而當(dāng)紫外光停止照射時(shí)，這種光也隨之很快消失，這種光稱為熒光。熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象。如前所述，分子吸收了某一波長(zhǎng)區(qū)的輻射能后，它的電子可躍遷至激發(fā)態(tài)，然后以熱能形式將這一部分能量釋放出來(lái)，本身又恢復(fù)到基態(tài)。如果吸收輻射能后處于電子激發(fā)態(tài)的分子以發(fā)射輻射的方式釋放這一部分能量，即為光至發(fā)光。再發(fā)射的波長(zhǎng)與分子所吸收的波長(zhǎng)可以相同，也可以不同。物質(zhì)所吸收光的波長(zhǎng)和發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。同一種分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，用同一波長(zhǎng)的激發(fā)光照射，可發(fā)射相同波長(zhǎng)的熒光，但其所發(fā)射的熒光強(qiáng)度隨著該物質(zhì)濃度的增大而增強(qiáng)。利用這些性質(zhì)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法，稱為熒光光譜分析法，也稱為熒光分光光度法。這種方法具較高的選擇性及靈敏度，試樣量少，操作簡(jiǎn)單，且能提供比較多的物理參數(shù)，現(xiàn)已成為生化分析和研究的常用手段。
ek9Y9eJ" n)6mf oe 1. 熒光的產(chǎn)生及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系：
}+3v5Nz; }
0^wJs 1) 熒光的產(chǎn)生：
WAWy 3 i WiBO8N,%` 當(dāng)光進(jìn)入某種物質(zhì)后，可以有兩種情況：一種是進(jìn)入物質(zhì)后，能量幾乎不被吸收；另一種是能量被全部或部分吸收。在后一種情況下，在吸收光的過(guò)程中，光能被轉(zhuǎn)移給分子。根據(jù)量子理論，分子從光波中吸收能量是不連續(xù)的、整份單位的形式發(fā)生，這些不連續(xù)的微小能量單位被稱為光量子。這也就是說(shuō)，頻率n的單色光的能量必定是hn的整數(shù)倍。每個(gè)光量子的能量
B!iz=+RNC1 530Z>q E=hn=hc/λ=hcω,
{S 2?
} QT[yw6Z 這里，h為普朗克常數(shù)，6.63×10－34J/s；ω為波長(zhǎng)，即1cm長(zhǎng)度中電磁波的數(shù)目。從公式可見，能量E與λ成反比。
?Gr2@,jlD JS{trqc1d 每個(gè)分子具有一系列分子的能級(jí)，處于基態(tài)的分子吸收了相應(yīng)頻率的能量后，可以從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)。被吸收的光量子的能量正好等于兩個(gè)能級(jí)之差。
v==]v2 - 5$;#=WAY 根據(jù)玻爾茲曼分布，分子在室溫時(shí)基本上處于電子的基態(tài)。吸收了紫外－可見光后，基態(tài)電子只能躍遷到單線激發(fā)態(tài)的各個(gè)不同的震動(dòng)能級(jí)。躍遷后能量較大的激發(fā)態(tài)分子，在很短時(shí)間內(nèi)（10—15s），由于分子間的碰撞或分子與晶格間的相互作用，以熱能形式或內(nèi)轉(zhuǎn)換方式消耗部分能量，從較高震動(dòng)能級(jí)回到最低震動(dòng)能級(jí)。如果這時(shí)分子不通過(guò)熱能或內(nèi)轉(zhuǎn)換形式來(lái)消耗能量，回到基態(tài)，而是通過(guò)發(fā)射出相應(yīng)的光量子來(lái)釋放能量，回到基態(tài)的各個(gè)不同震動(dòng)能級(jí)時(shí)，就發(fā)射熒光。由于在發(fā)射熒光前已有一部分能量消耗，所以發(fā)射熒光能量要比吸收紫外光的能量小，也就是熒光的特征波長(zhǎng)比吸收的特征波長(zhǎng)要長(zhǎng)。
'(o*l gxf{/EjH 2) 熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系：
c( 5r Q
xg)W b# 在許多有機(jī)物和無(wú)機(jī)物中，只有小部分物質(zhì)會(huì)發(fā)生強(qiáng)的熒光，它們的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜及熒光強(qiáng)度與它們的結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系。強(qiáng)熒光物質(zhì)在分子結(jié)構(gòu)上往往具有如下特征：
NL7CeHs5 ER4j=O# a. 具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)：共軛體系越大，離域π電子越容易激發(fā)，越容易產(chǎn)生熒光。大部分熒光物質(zhì)都有芳香環(huán)或雜環(huán)。芳香環(huán)越大，其熒光峰移向波長(zhǎng)方向，且熒光強(qiáng)度也往往較強(qiáng)。具有相同共軛環(huán)數(shù)的芳香族化合物，線性環(huán)結(jié)構(gòu)者的熒光波長(zhǎng)比非線性者長(zhǎng)。
1w|C+m/( b. 具有剛性平面結(jié)構(gòu)：熒光量子產(chǎn)率高的熒光物質(zhì)，其分子多為平面構(gòu)型，并具有一定的剛性。
M+lj g&fy c. 具有最低的單線電子激發(fā)態(tài)S1為π，π1型。
fRT4,; d. 取代基團(tuán)為給電子取代基。芳香烴及雜環(huán)化合物的熒光光譜和熒光量子產(chǎn)率常隨取代基的變化而變化。若取代基為給電子取代基，則熒光強(qiáng)度增加。屬于這一類基團(tuán)的有—NH2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN。
CU G3C 2. 熒光分光光度計(jì)：
y/d/#}\: "pLWJvj6- 熒光分析從入射光的直角方向、黑背景下檢測(cè)樣品的發(fā)光信號(hào)，這與紫外分光光度法從入射光方向、在亮背景下檢測(cè)光吸收信號(hào)相比，具有更高的靈敏度。此外熒光分析在檢測(cè)器前面是發(fā)射單色器，樣品信號(hào)經(jīng)過(guò)分光后可以去除樣品以外的輻射，從而為方法的專一性提供了有力的條件。
[<H'JsJl SuuLB6{u3 用于測(cè)量熒光的儀器種類很多，如熒光分析燈、熒光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)及測(cè)量熒光偏振的裝置等。其中實(shí)驗(yàn)室里常用的是熒光分光光度計(jì)。
$V?h68[c R-\a3q 熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)包括五個(gè)基本部分：
:,]*~Nl ,Q>R t V 1) 激光光源：用來(lái)激發(fā)樣品中熒光分子產(chǎn)生熒光。常用汞弧燈、氫弧燈及氘燈等，目前熒光分光光度計(jì)以用氘燈為多。
LH _rc 2) 單色器：用來(lái)分離出所需要的單色光。儀器中具有兩個(gè)單色器：一是激發(fā)單色器，用于選擇激發(fā)光波長(zhǎng)；二是發(fā)射單色器，用于選擇發(fā)射到檢測(cè)器上的熒光波長(zhǎng)。
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